慢病毒滴度测定方法,定量测定病毒滴度

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对慢病毒进行滴度检测，是检验慢病毒是否合格的方法之一。

同时，由于慢病毒后续是用来进行细胞感染的，因此进行滴度测定可让我们知道病毒颗粒的含量，方便后续做MOI实验。

这样就不会因为滴度过低而导致转染成功率降低，也不会因为滴度过高而浪费慢病毒或引起宿主细胞的死亡。

由于慢病毒载体的不同以及客户需求的不同，有的慢病毒会带有荧光标记，而有的没有，故而滴度检测也有不同的方法。

带荧光标记的慢病毒滴度检测

1. 检测前一天，对状态良好的293T细胞进行传代，铺96孔板，每一种慢病毒设8个梯度孔，置于37°C，5%CO2培养箱中培养；

2. 第二天，准备8个无菌EP管，每个EP管中加入180μl新鲜的完全培养基，取待测定病毒液20μl加入到第一个EP管中（标记10μl），混匀后取20μl病毒稀释液加入到第二个EP管中（标记1μl），以此类推，直到稀释到最后一管；

3. 吸弃96孔板中原有培养基，每孔加入100μl稀释好的病毒液，做好标记，小心操作，不要吹起细胞，置于37°C，5%CO2培养箱中培养72h；

4. 72h后，荧光显微镜下观察每孔带荧光的细胞个数，假设在加入10-6μl病毒液的孔中观察到2个带有荧光的细胞，说明该孔至少有两个病毒颗粒感染了细胞，滴度即为2/（10-6）=2×106，单位为TU/μl，即2×109，单位为TU/ml。

不带荧光标记的慢病毒滴度检测（相对定量PCR）

1. 转染前一天，将293T细胞按照每孔1×105个细胞数接种到24孔板上；

2. 24h后，弃去其中2个孔的培养基，消化细胞，重悬并计数，记录真实细胞数目，每孔细胞数应当为2×105个左右；

3. 将其他孔中的培养基吸去，换为0.5mL新鲜的培养基。每种病毒做3个梯度的感染，分别加入0.1μl、1μl、10μl的病毒原液，病毒可先做10倍梯度稀释，最后每个孔中加入10μl；

4. 48h后用PBS清洗并将细胞吹打下来，离心收集细胞；

慢病毒滴度计算公式：

滴度（TU/mL）=（C×2N×D×1000）/V，其中C=每基因组中整合的病毒数；2N=病毒感染时基因组数目（每孔大约有2×105，对应大约4×105的基因组）；D=慢病毒的稀释倍数；V=加入的慢病毒的体积。

好了，慢病毒包装的相关基础知识小薇就暂时分享到这里了，后续有其他问题咱们再继续~

慢病毒滴度检验办法有哪些？

中洪博元的慢病毒： 1 可以用倍数稀释法检测滴度。
2 可以用QPCR方法检测。

慢病毒滴度的计算

慢病毒滴度公式计算IU/ml。IU/ml =（F×Ci/V)×D，其中F：细胞阳性率（一般选择慢病毒梯度稀释后，感染细胞阳性率接近30%的孔进行滴度计算），Ci：转导时细胞总数，V：接种病毒的体积，D：病毒载体稀释倍数；

如您在进行慢病毒感染细胞过程中，效率比较低，可以考虑加入Entrvius-LV感染增强剂，EnvirusTM系列产品不含病毒以及蛋白等其他生物来源成分，不参与病毒和细胞的生理过程。由于EnvirusTM对病毒的吸附和独有的浓缩功能，通过物理作用将病毒大量富集在细胞表面，大大增加病毒与细胞的接触，最大限度促进病毒感染细胞，通常情况下，比不用增强剂， 提高感染效率几倍到几十倍不等 。同时，由于EnvirusTM系列采用纳米技术合成，颗粒均匀，细胞毒性极低，有效减少细胞死亡。

 

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